Disertasi

Pengembangan PCR Multipleks untuk Identifikasi Cepat Spesies dan Toksigenisitas (Toksigenik, Non-toksigenik, NTTB) C.diphtheriae, C.ulcerans, dan C.pseudotuberculosis yang Berpotensi Menyebabkan Difteri. = Development of Multiplex PCR for Rapid Species and Toxigenicity (Toxigenic, Nontoxigenic, NTTB) Identification of C. diphtheriae, C. ulcerans, and C. pseudotuberculosis Potentially Causative Agent of Diphtheria.

Latar Belakang: Masalah utama penyakit difteri adalah tingginya kematian kasus atau case fatality rate (CFR) dan salah satu upaya untuk menurunkannya adalah dengan penemuan kasus dini disertai penatalaksanaan secara cepat dan tepat. Namun demikian hal ini sulit dilakukan mengingat gambaran dini penyakit tidak khas menyerupai faringitis atau laringitis pada umumnya. Di sisi lain, diagnosis laboratorium dengan metode konvensional sebagai baku emas (gold standard) membutuhkan waktu 3-5 hari, sedangkan diagnosis dengan PCR memiliki beberapa keterbatasan, terutama dalam identifikasi strain nontoxigenic tox-gene bearing (NTTB). Penelitian ini merupakan upaya untuk melengkapi beberapa kekurangan metode diagnostik yang sudah ada. Penelitian bertujuan untuk mendapatkan metode identifikasi spesies dan toksigenisitas Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans dan Corynebacterium pseudotuberculosis yang berpotensi menyebabkan difteri secara cepat dan akurat dengan biaya terjangkau menggunakan teknik PCR multipleks berdasarkan hasil analisis gen dtxR, pld dan dtx. Metode: Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi dan Virologi, Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan tahun 2011-2014. Sampel penelitian berupa 8 strain referensi (ATCC dan NCTC), 6 DNA sintetis, 36 isolat tersimpan, dan 309 sampel klinis. Kegiatan yang dilakukan mulai dari tahap desain dan analisis in silico, dilanjutkan dengan uji in vitro. Indikator keberhasilan dinilai dari efektifitas (kecepatan), efisiensi (biaya) dan akurasi metode yang dikembangkan dibandingkan dengan metode konvensional dan PCR yang sudah ada. Hasil: PCR multipleks yang dikembangkan menggunakan target gen dtxR dan dtx (tanpa gen pld) digunakan untuk identifikasi spesies sekaligus toksigenisitas C.diphtheriae, C.ulcerans, dan C.pseudotuberculosis secara akurat dengan sensitifitas 100% dan spesifisitas 99% dibandingkan dengan gold standard. Metode ini relatif lebih murah (sekitar Rp 50.000,-/sampel) dan lebih cepat (60-90 menit) dibandingkan dengan metode diagnostik yang sudah ada serta dapat diaplikasikan pada isolat tersimpan maupun spesimen klinis. Kesimpulan: Penelitian berhasil mendapatkan sebuah metode PCR multipleks untuk identifikasi spesies dan toksigenisitas C.diphtheriae, C.ulcerans, dan C.pseudotuberculosis secara cepat dan akurat dengan biaya relatif terjangkau.
Kata Kunci: PCR multipleks, C.diphtheriae, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis.



Background: A major problem of diphtheria disease is the high case fatality rate (CFR). The effort to reduce CFR by early case detection could be onerous because the signs and symptoms of diphtheria disease are similar with pharingitis and laryngitis caused by other microorganisms. More over, the laboratory diagnosis of diphtheria by conventional method is time consuming (3-5 days) while PCR methods have some limitations, particularly in identifying the NTTB strains that implicate to determine bacterial toxigenicity. This study aimed to develop a multiplex PCR for identifying species and toxigenicity (toxigenic, nontoxigenic, NTTB) of C. diphtheriae, C. ulcerans, and C. pseudotuberculosis potentially causative agents of diphtheria rapidly, accurately, and low cost. Methods: The study was carried out in the Bacteriology and Virology Laboratory, Center for Biomedical and Basic Technology of Health in 2011-2014. The samples included 8 reference strains, 6 synthetic DNAs, 36 bacterial stored isolates, and 309 clinical specimens. The study was in silico activities to an in vitro test of the multiplex PCR. Accuracy, speed, and cost effectiveness of the multiplex PCR are compared to established diagnostic methods, included conventional method as gold standard. Result: Multiplex PCR with targeted gene of dtxR and dtx has 100% sensitivity and 99% specificity compared to the gold standard. The multiplex PCR has a short TAT (turn around time) and it is cost effective (about IDR 50.000/sample). Conclusion: The study succeeds to design a multiplex PCR to identify species and toxigenicity of C. diphtheriae, C. ulcerans, and C. pseudotuberculosis rapidly, accurately, and cost effective.
Key Words: Multiplex PCR, C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis.